熒光定量PCR的檢測離不開熒光定量PCR試劑和
qPCR熒光定量PCR儀，儀器由熒光定量系統(tǒng)和計算機組成，用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光。與實時設(shè)備相連的計算機收集熒光數(shù)據(jù)。
對于熒光定量PCR儀的評價，相信大家一定是不知道的。熒光定量PCR儀涉及很多溫度、光電信號等，專業(yè)性評估，還有就是不知道從哪里入手。今天我們梳理下在核酸檢測實驗室中如何通過試驗來評價熒光定量PCR儀。
qPCR熒光定量PCR儀的試驗設(shè)計：
一、試驗準備
1、有證標準物質(zhì)：國內(nèi)外有證標準物質(zhì)，標準物質(zhì)類型為質(zhì)粒DNA或RNA。不推薦使用自制沒有進行定量的質(zhì)控品。
2、熒光染料：可以選用試劑盒自帶的ROX染料或購買標準熒光染料。
3、熒光定量PCR方法：需要使用經(jīng)過驗證過的熒光定量方法，擴增效率90%-110%（越接近100%越好）；R2大于0.99；檢測限應(yīng)低于10copies/反應(yīng)。
4、反應(yīng)體系：質(zhì)量高口碑好的反應(yīng)體系。
5、耗材：儀器推薦使用的專用于熒光定量PCR的耗材。
6、反應(yīng)條件：常規(guī)熒光定量PCR反應(yīng)條件，普通模式，40個循環(huán)。不建議使用快速模式和預擴增反應(yīng)條件。
二、重復性試驗
選擇高中低濃度標準物質(zhì)進行檢測（推薦濃度為5000copies/反應(yīng)、500copies/反應(yīng)和50copies/反應(yīng)），每個濃度至少5次重復，樣品管隨機放置在反應(yīng)板中心和邊緣的不同位置。Ct值變異系數(shù)不大于3%。
如果qPCR熒光定量PCR儀檢測中使用雙重或多重熒光檢測，可設(shè)計如用FAM探針擴增用VIC通道檢測，檢測結(jié)果不應(yīng)該有高于閾值線的熒光信號。
